Mobilstrålning kan påverka protein uttryck i mänsklig hud

Mobilstrålning kan påverka protein uttryck i mänsklig hud

Anu Karinen, Sirpa Heinävaara, Reetta Nylund och Dariusz Leszczynski *
* Motsvarande författare: Dariusz Leszczynski dariusz.leszczynski @ stuk.fi
STUK – Strålsäkerhetscentralen myndigheten 4 Flänsvägen, 00880 Helsingfors, Finland

BMC Genomics 2008, 9:77 doi: 10.1186/1471-2164-9-77

Den elektroniska versionen av denna artikel är den kompletta ett och kan hittas online på: http://www.biomedcentral.com/1471-2164/9/77

Mottagen: 13 November 2007
Accepterade: 11 feb 2008
Publicerad: 11 februari 2008

© 2008 Karinen et al, licenstagare BioMed Central Ltd

Detta är en Open Access artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt att originalet arbetet korrekt angiven.

Bakgrund
Vi har tidigare visat att den mobila telefonen strålning (radiofrekventa modulerade elektromagnetiska fält, RF-EMK) förändrar proteinuttryck i humana endotel-cellinje. Detta betyder inte att liknande svar kommer att äga rum i människokroppen utsätts för denna strålning. Därför i detta pilotprojekt mänskliga frivilliga studie, med hjälp av proteomik metod, har vi undersökt om en lokal exponering av mänsklig hud för RF-EMF orsakar förändringar i proteinuttryck i levande människor.
Resultaten

Liten del av underarmen hud i 10 kvinnliga försökspersoner utsattes för RF-EMF (Specific Absorption Rate SAR = 1,3 W / kg) och stansbiopsier samlades från exponerade och icke-exponerade områdena av huden. Proteiner extraherade från biopsier separerades med användning av 2-DE-och proteinuttryck förändringar analyserades med användning av PDQuest mjukvara. Analys har identifierat 8 proteiner som statistiskt signifikant påverkas (ANOVA och Wilcoxon test). Två av proteinerna var närvarande i alla 10 försökspersoner. Detta antyder att proteinuttryck i human hud kan påverkas av exponering för RF-elektromagnetiska fält. Antalet drabbade proteiner liknade antalet drabbade proteiner som observerats i vår tidigare in vitro studier.
Slutsats

Detta är den första studien som visar att molekylära nivån förändringar kan ske i frivilliga försökspersoner som svar på exponering för RF-EMF. Vår studie bekräftar att proteomik screening kan identifiera protein mål för RF-EMF i mänskliga försökspersoner.
Bakgrund

Fysiologiska funktionerna hos människokroppen regleras av elektriska strömmar. Är därför inte förvånande att placera kroppen i elektromagnetiska fält av tillräcklig styrka, kan påverka fysiologiska processer. Möjligheten induktion av biologiska och hälsoeffekter av låga energi som strålning från mobiltelefoner (radiofrekvens-modulerade elektromagnetiska fält: RF-EMF) är en kontroversiell fråga. Trots år av forskning finns det fortfarande pågår diskussion om huruvida RF-EMF kan ge upphov till några fysiologiskt relevanta effekter [1]. Den stora majoriteten av den hittills utfört forskning har fokuserat på cancer. Dock RF-EMF också misstänkt som potentiell orsak till sådana sjukdomar som sömnstörningar, huvudvärk eller allergiliknande symptom [2].

Vi har föreslagit att proteomik screening kan användas för att avslöja molekylära mål för RF-EMF och hjälp att förstå den möjliga biokemiska mekanismen för RF-EMF-inducerade effekter [3]. Våra tidigare proteomik studier har visat att förändringar i proteinuttryck och aktivitet (fosforylering) inducerades i human endotelcellinjen EA.hy926 som utsattes för RF-EMF [4-7]. Dessa in vitro observeras effekter, inte automatiskt innebär att liknande ändringar skulle hända i cellerna i mobiltelefonanvändare. Därför var denna förstudie genomförts för att avgöra om en lokal exponering av mänsklig hud för RF-EMF kommer att leda till några förändringar i proteinuttryck och om det kommer att vara möjligt att hitta en gemensam protein (er) som svarar på RF-EMF i alla volontärer .

Resultaten
Etisk tillstånd att utföra denna studie erhölls från etiska kommittén för avdelningen för kirurgi Sjukvårdsdistriktets Helsingfors och Nyland, Finland. En liten hudyta av en underarm av 10 av samma kön (kvinna) frivilliga (ålder 27 – 65 år, menar 51 år) bestrålades i 1 timme med 900 MHz GSM signal vid Specific Absorption Rate (SAR) på 1,3 W / kg, hjälp av särskilt utformade exponeringsuppställning [8]. Mobiltelefonen säkerhetsgränsen SAR är 2,0 W / kg, som rekommenderas av Internationella kommissionen för icke-joniserande strålning (ICNIRP).

Omedelbart efter exponering, hade en stansbiopsi av den exponerade arean av huden (experimentellt prov) tas av en läkare. En annan stansbiopsi togs från andra, icke-exponerade, underarm (sken prov). I denna experimentella uppställning varje frivillig fungerade som sin egen bluffkontrollen. Både den exponerade och oexponerade hudprover från alla försökspersoner var omedelbart snabbfrystes i flytande kväve och lagrades före extraktion av proteiner.

Proteiner från samtliga prover extraherades med användning av Trizol-reagens (Invitrogen) och separerades med användning av 2-dimensionell gelelektrofores (2-DE) med pH-gradient området 4-7 i den första dimensionen och 9% SDS-PAGE-gel i den andra dimensionen (GE Healthcare). Proteinerna detekterades genom silverfärgning och fläck fördelningsmönstret analyserades med användning av PDQuest 7,2 mjukvara (Bio-Rad).

Vi har analyserat ett fragment av proteomanalys: proteiner med isoelektriska punkten (pl) 4-7 och en molekylvikt <40 kDa, eftersom proteinet plats separationen i 2-DE inom detta område var tydligt urskiljbar (figur 1). För det första använder PDQuest installerades för varje volontär genererade en konstgjord gel, genom att kombinera profiler proteinexpression från falskt och exponerade prover. Därefter var alla 10 konstgjorda geler kombineras till en enda konstgjorda herre gel och de differentiellt uttryckta fläckar protein, som påvisas i minst 4 frivilliga analyserades statistiskt.

Figure 1. Artificiell herre gel för alla bluff och utsatta prover hud av alla 10 volontärer. Statistiskt signifikant påverkade proteinfläckar är märkta i rött färg (minskat uttryck) och i grön färg (ökad uttryck).

Förhållandet mellan exponerade och simulerad injektion prov uttryck analyserades plats av plats, efter logaritm transformation med variansanalys (ANOVA). På grund av ett litet antal och eventuella överträdelser av modellantaganden, var förhållandena också studerats med Wilcoxon testet. Den statistiska analysen har identifierat 8 differentiellt uttryckta proteiner där förändringen i uttrycket var statistiskt signifikant bland de identifierade 579 proteiner fläckar (tabell 1). Två av proteinfläckar (# 3701, # 4801) var närvarande i alla 10 volontärer vilket visar att det är möjligt att finna gemensamma, svarar proteiner bland alla volontärer. De p-värden är inte justerat för multipla jämförelser.

Tabell 1. Listan av proteiner som var närvarande i minst 4 frivilliga och som uttryck har ändrats i statistiskt signifikant sätt (<0,05) som bestäms av variansanalys och Wilcoxons test. Kvot = exponerade provet uttryck / bluff prov uttryck.

Diskussion
Proteomics närma att studera effekter av strålning från mobiltelefoner på celler har använts hittills endast två forskargrupper, vår i Helsingfors och gruppen Zhejiang University, Hangzhou, Kina. Våra studier, som använder humana endotelceller cellinjer har visat att mobiltelefonen strålning inducerar statistiskt signifikanta förändringar i uttrycket av flera tiotals proteiner [6], och att svaret hos cellen kan vara proteomanalys-beroende [7]. I en studie, har gruppen i Kina hittades inte statistiskt signifikanta skillnader i proteinuttryck i MCF-7 celler [9]. Anledningen till det kan vara för låg antalet försök på MCF-7 studie [9]. I våra studier statistisk analys baserades på 10 olika experiment, medan Zeng et al. [9] baserat sin analys på bara tre replikat. En annan orsak till skillnaden kan vara annorlunda känslighet MCF-7 celler jämfört med våra endotelceller cellinjer EA.hy926 och EA.hy926v1. I den andra studien från Zhejiang University [10] fann 4 differentiellt uttryckta proteiner i linsepitelceller, bland dem stress proteinet Hsp70.

De erhållna resultaten, vilket tyder på effekt av strålning från mobiltelefoner på protein uttryck i humana cellinjer, inte automatiskt att denna exponering kommer att få någon effekt på protein uttryck i människor. De hittills utförda mänskliga frivilliga studier har fokuserat på kognitiva svar RF-EMF [2] och det finns ingen information tillgänglig om proteomet, liksom transkriptom, svar på strålning från mobiltelefoner hos människor. Denna studie är så vitt vi vet, den första där mänsklig reaktion på RF-EMF undersöktes på molekylär nivå. Våra resultat tyder på att human hud kan svara på RF-elektromagnetiska fält och förändring proteinexpression profil. Intressant, när vi justerar resultatet av vår tidigare cellulär studie [6] med storleken på proteomet analyseras i föreliggande studie (pl 4-7, <40 kDa) antalet statistiskt signifikant påverkas proteiner verkar vara liknande detta och i tidigare [6] Studien, 8 fläckar och 9 fläckar, respektive. Antalet av differentiellt uttryckta proteiner fläckar i båda studierna är lägre än antalet förväntade falska positiva. Men som vi visat experimentellt [6] och diskuterats tidigare [11] är det troligt att en del av proteinerna blir faktiskt riktiga positiva. Men utan ytterligare testning, är det inte möjligt att förutsäga huruvida dessa förändringar kommer att påverka huden fysiologi.

Slutligen bekräftar vår studie att det föreslagna av oss proteomik strategi [3] kan identifiera protein mål för RF-EMF. Detta sätt att EMF forskning har därefter accepterats av EMF forskarna [12,13] och har tagits in i 2006 World Health Organization forskningsagenda [14]. Men är ny och större studier snarast för att stärka våra pilot observationer och bestämma vilken effekt mobiltelefon exponering kan ha på mänskliga vävnader.

Slutsats
▪ mobilstrålning kan påverka protein uttryck i mänsklig hud.
▪ fysiologiska betydelsen av denna förändring är inte känd och kräver ytterligare studier.
▪ Större mänskliga frivilliga studier kommer att behövas för att bekräfta resultaten av denna pilotstudie.
▪ Proteomics screening är giltig metod för sökning efter molekylära mål för strålning från mobiltelefoner. Utan detta tillvägagångssätt att identifiera de proteiner som svarar på strålning från mobiltelefoner inte skulle vara möjligt och rimligt.

M e t o d e r
Etiska frågor
Etisk tillstånd att utföra denna studie erhölls i enlighet med Helsingforsdeklarationen från den etiska kommittén vid institutionen för kirurgi av sjukhuset i Helsingfors och Nylands, Finland (beslut # 127/2005 utfärdades den 23 november 2005). Varje volontär informerades i detalj om alla experimentella förfaranden och vart och ett av dem har undertecknat informerat samtycke (på finska).
Exponering av volontärer till strålning från mobiltelefoner

Försökspersoner exponerades för 900 MHz GSM-mobiltelefon strålning i en experimentell uppställning som beskrivs i detalj på annat håll [8]. Källan för bestrålning var en halvvågsdipol matas med en datorstyrd GSM-telefon. Specific Absorption Rate (SAR) induceras i huden var 1,3 W / kg vad som finns under ICNIRP: s säkerhetsföreskrifter (2,0 W / kg). Under exponeringen litet område av den högra underarmen bestrålades i en timme. Den andra, icke-bestrålade underarmen användes som bluffkontrollen. Omedelbart efter exponering hud punch-biopsier togs från de exponerade och icke exponerade huden för proteinanalys.
Protein extraktion från hudbiopsier

Hud stansbiopsier, bestående av både dermis och epidermis, men utan den underliggande fettvävnad och frystes omedelbart efter skörd i flytande kväve och lagrades vid -80 ° C. Isolering och separation av proteiner utfördes på den förblindade sätt. Proteinerna isoleras från fryst huden med användning av TRIzol-reagens ®-protokollet som beskrivits av tillverkaren (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) med några modifikationer. I korthet var de hackade huden punch-biopsier nedsänkt i 0,5 ml iskall TRIzol reagens och homogeniseras på is med 70 slag i stöt i DUALL 1 ml vävnad grinder (Kimble Chase Life Science och produkter Forskning, Vineland, NJ, USA) . Efter fasseparation av TRIzol-reagens, varefter den organiska fasen innehållande DNA och proteiner uppsamlades. DNA utfälldes därefter med etanol och proteiner isolerades från fenol-etanol supernatanten. De proteiner utfälldes sedan genom isopropylalkohol och pelleterades vid 12000 X g under 10 min vid 4 ° C. Proteinet Pelleten tvättades 3 gånger med 0,3 M guanidinhydroklorid lösning i 95% etanol och en gång med 99,5% etanol. Under extraktions-pelletar maldes med mortelstöt pelleten för att förbättra lösligheten av proteinerna. Efter varje tvättsteg gjordes proteiner centrifugerades 7500 x g under 5 min vid 4 ° C. Den lufttorkade proteinet Pelleten löstes i 2-DE-rehydratisering buffert innehållande 9 M urea, 2% (vikt / volym) CHAPS, 0,5% (volym / volym) IPG-buffert pH 4-7, och 5 mg / ml DTT (tillsatt som färska). Proteinkoncentrationen hos provet mättes med användning av Bradford-metoden. Proverna lagrades vid -80 ° C.
Proteinseparation med 2-DE

Proteiner separerades genom vanliga 2-DE. Kortfattat, den första dimensionen genomfördes i IPGphor ™ (GE Healthcare, Storbritannien) isoelektrisk fokusering (lEF)-apparat. Linjär, 24 cm lång, pH 4-7 Immobiline ™ DryStrip geler (IPG-remsor, GE Healthcare, Storbritannien) rehydrerades i remsan hållare under 4 timmar i 0,45 ml rehydratisering buffert innehållande 9 M urea, 2% (vikt / volym) CHAPS, 0,5% (volym / volym) IPG-buffert, pH 4-7, 1,2% (volym / volym) DeStreak ™-reagens, ett spår av bromfenolblå och 150 | ig av totalt protein. IEF utfördes vid +20 ° C med hjälp av följande steg och håll inställningar: 50 V, 8 h, 100 V, 1 h, 500 V, 1 h, 1000 V, 1 h, 2000 V, 1 h; 8000 V , tills 95.000 Vh uppnåddes. Därefter om-IPG-remsorna inkuberades vid rumstemperatur i jämviktsbuffert (50 mM Tris-HCl, pH 8,8, 6 M karbamid, 30% (volym / volym) glycerol, 2% (vikt / volym) SDS, en spårmängd bromfenol blå och 10 mg / ml DTT) under 15 min och under ytterligare 15 min i samma buffert som innehöll 25 mg / ml jodacetamid i stället för DTT. Den andra dimensionen-separation genomfördes med användning av 9% SDS-PAGE-geler. Elektrofores utfördes vid 10 ° C med användning av en Ettan ™ DALTsix elektroforesenhet (GE Healthcare) vid en konstant effekt av 3,5 W / gel i 0,5 h och därefter 13 W / gel tills färgfronten nådde botten av gelén (cirka 4 h). De färdiga geler var silverfärgades att visualisera proteinfläckar. Färgade geler scannas in datorn med GS-710 Kalibrerad Imaging densitometer (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Gelerna analyserades med användning av PDQuest 7,2 mjukvara (Bio-Rad).
Förkortningar

CHAPS, 3 – [(3-kolamidopropyl) dimetylammonio]-1-propansulfonat, 2-DE, 2-dimensionell elektrofores, DTT, ditiotreitol; EA.hy926, mänsklig endotelcellinjen, ICNIRP, International Commission on Non-joniserande strålning; lEF, isoelektrisk fokusering; IPG, immobiliserad pH-gradient; MCF-7, humana bröst-adenokarcinom-cellinje; pl, isoelektrisk punkt, RF-EMF, radiofrekvent modulerat elektromagnetiskt fält; SAR specifik absorptionshastighet; SDS, natriumdodecylsulfat, SDS-PAGE , natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores; Tris-HCl, tris (hydroximetyl) aminometan-hydroklorid;
Författarnas bidrag

AK utfört de proteomik experimenten och utförde analys av proteomik data. RN hjälp i utformningen av studien deltog skriftligen bidragsmedel studien, hjälp vid analys av proteomik data. SH utfört statistisk analys av data. DL utformade för studien erhöll bidrag finansierar studien, som samordnas genomförande och analys av resultaten och skrev utkastet till manuskriptet. Alla författare deltog i skrivandet av den slutliga versionen av manuskriptet, läste den och godkänt den.

Tack

Vi tackar Dr J. Halttunen (Centralsjukhuset i Helsingfors universitet) för att ta hud biopsier. Finansieringen kom från Tekes – Finska Utvecklingscentralen för teknologi och innovationer (HERMO projektet) och STUK-Strålsäkerhetscentralen myndigheten.
Referenser

Krewski D, Glickman BW, Habash RW, Habbick B, Lotz WG, Mandeville R, Prato FS, Salem T, Weaver DF: Senaste framstegen inom forskningen på radiofrekventa fält och hälsa: 2001-2003.

J Toxicol Environ Health B Crit Rev 2007, 10:287-318. PubMed abstrakt | Utgivare Full Text OpenURL

Seitz H, Stinner D, Eikmann T, herr C, Röösli M: Elektromagnetisk överkänslighet (EHS) och subjektiva besvär hälsa i samband med elektromagnetiska fält från mobiltelefoner kommunikation – en litteraturstudie publicerade mellan 2000 och 2004.

Science of Total miljö 2005, 349:45-55. Utgivare Hela texten OpenURL

Leszczynski D, Joenväärä S: Proteomics: nytt sätt att fastställa möjliga biologiska effekter av strålning från mobiltelefoner.

Nature Genetics 2001, (Suppl 27): 67. Utgivare Hela texten OpenURL

Leszczynski D Joenväärä S Reivinen J Kuokka R: Ej termisk aktivering av hsp27/p38MAPK påkänning reaktionsväg genom mobiltelefonstrålning i humana endotelceller: molekylär mekanism för cancer-och blod-hjärnbarriären-relaterade effekter.

Differentiering 2002, 70:120-129. PubMed abstrakt | Utgivare Full Text OpenURL

Leszczynski D, Nylund R, Joenväärä S Reivinen J: Tillämpning av Discovery Science strategi för att fastställa biologiska effekter av strålning från mobiltelefoner.

Proteomik 2004, 4:426-431. PubMed abstrakt | Utgivare Full Text OpenURL

Nylund R, Leszczynski D: Proteomik analys av humant endotel-cellinje EA.hy926 efter exponering för GSM 900 strålning.

Proteomik 2004, 4:1359-1365. PubMed abstrakt | Utgivare Full Text OpenURL

Nylund R, Leszczynski D: strålning från mobiltelefoner orsakar förändringar i gen-och proteinuttryck i humana endotelceller cellinjer och svaret verkar vara genom-och proteom-beroende.

Proteomik 2006, 6:4769-4780. PubMed abstrakt | Utgivare Full Text OpenURL

Toivonen T, Toivo T, Puranen L, Jokela K: Installation och dosimetri för exponering av mänsklig hud in vivo till RF-EMF vid 900 MHz.

Bioelectromagnetics 2007, under tryckning.

DOI 10.1002/bem.20383
PubMed abstrakt | Utgivare Full Text OpenURL

Zeng Q, Chen G, Weng Y, Wang L, Chiang H, Lu D, Xu Z: Effekter av globala system för mobil kommunikation 1800 MHz radiofrekventa elektromagnetiska fält på gen-och proteinuttryck i MCF-7 celler.

Proteomik 2006, 6:4732-4738. PubMed abstrakt | Utgivare Full Text OpenURL

Li HW, Yao K, Jin HY, Sun LK, Lu DQ, Yu YB: proteomik analys av humana linsepitelceller utsätts för mikrovågor.

JPN J Ophtalmol 2007, 51:412-416. Utgivare Hela texten OpenURL

Leszczynski D: strålning från mobiltelefoner och genuttryck.

Strålning Res 2007, 167:121. PubMed abstrakt | Utgivare Full Text OpenURL

Leszczynski D: Behovet av en ny strategi för studier av biologiska effekter av elektromagnetiska fält.

Proteomik 2006, 6:4671-4673. PubMed abstrakt | Utgivare Full Text OpenURL

Leszczynski D, Meltz ML: Frågor och svar om tillämpning av proteomik och transkriptomik i EMF forskning.

Proteomik 2006, 6:4674-7. PubMed abstrakt | Utgivare Full Text OpenURL

World Health Organization: [http://www.who.int/peh-emf/research/rf_research_agenda_2006.pdf] webcite

WHO forskningsagenda för radiofrekventa fält. 2006. OpenURLNytt! Klicka på orden ovan om

Mobile phone radiation might alter protein expression in human skin

Anu Karinen, Sirpa Heinävaara, Reetta Nylund and Dariusz Leszczynski*

Author Affiliations

STUK – Radiation and Nuclear Safety Authority, Laippatie 4, 00880 Helsinki, Finland

For all author emails, please log on.

BMC Genomics 2008, 9:77 doi:10.1186/1471-2164-9-77

 

The electronic version of this article is the complete one and can be found online at: http://www.biomedcentral.com/1471-2164/9/77

 

Received: 13 November 2007
Accepted: 11 February 2008
Published: 11 February 2008

 

© 2008 Karinen et al; licensee BioMed Central Ltd.

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

Background

Earlier we have shown that the mobile phone radiation (radiofrequency modulated electromagnetic fields; RF-EMF) alters protein expression in human endothelial cell line. This does not mean that similar response will take place in human body exposed to this radiation. Therefore, in this pilot human volunteer study, using proteomics approach, we have examined whether a local exposure of human skin to RF-EMF will cause changes in protein expression in living people.

Results

Small area of forearm’s skin in 10 female volunteers was exposed to RF-EMF (specific absorption rate SAR = 1.3 W/kg) and punch biopsies were collected from exposed and non-exposed areas of skin. Proteins extracted from biopsies were separated using 2-DE and protein expression changes were analyzed using PDQuest software. Analysis has identified 8 proteins that were statistically significantly affected (Anova and Wilcoxon tests). Two of the proteins were present in all 10 volunteers. This suggests that protein expression in human skin might be affected by the exposure to RF-EMF. The number of affected proteins was similar to the number of affected proteins observed in our earlier in vitro studies.

Conclusion

This is the first study showing that molecular level changes might take place in human volunteers in response to exposure to RF-EMF. Our study confirms that proteomics screening approach can identify protein targets of RF-EMF in human volunteers.

Background

Physiological functions of human body are regulated by electric currents. Therefore, is not surprising that placing human body within electromagnetic field, of sufficient strength, may affect physiological processes. The possibility of induction of biological and health effects by low energy radiation emitted by mobile phones (radiofrequency-modulated electromagnetic fields: RF-EMF) remains a controversial issue. In spite of years of research, there is still ongoing discussion whether RF-EMF could induce any physiologically relevant effects [1]. The vast majority of the so far conducted research has focused on cancer. However, RF-EMF is also suspected as potential cause of such ailments as sleep disorders, headaches or allergy-like symptoms [2].

We have proposed that proteomics screening may be used to reveal molecular targets of RF-EMF and help to understand the possible biochemical mechanism of the RF-EMF-induced effects [3]. Our earlier proteomics studies have shown that changes in protein expression and activity (phosphorylation) were induced in human endothelial cell line EA.hy926 that was exposed to RF-EMF [47]. These in vitro observed effects, however, do not automatically mean that similar changes would happen in the cells of mobile phone users. Therefore, the present pilot study was undertaken to determine whether a local exposure of human skin to RF-EMF will induce any changes in protein expression and whether it will be possible to find common protein(s) that respond to RF-EMF in all volunteers.

Results

Ethical permit to perform this study was obtained from the Ethics Committee of Department of Surgery of Hospital District of Helsinki and Uusimaa, Finland. A small skin area of a forearm of 10 of same sex (female) volunteers (age 27 – 65 years; mean 51 years) were irradiated for 1 hour with 900 MHz GSM signal at specific absorption rate (SAR) of 1.3 W/kg, using specially designed exposure setup [8]. The mobile phone safety limit SAR is 2.0 W/kg, as recommended by the International Commission on Non-Ionizing Radiation Protection (ICNIRP).

Immediately after the exposure, a punch biopsy of the exposed area of skin (experimental sample) was taken by a physician. Another punch biopsy was taken from the other, non-exposed, forearm (sham sample). In this experimental set-up each volunteer acted as its own sham control. Both exposed and non-exposed skin samples of all volunteers were immediately snap-frozen in liquid nitrogen and stored before extraction of proteins.

Proteins from all samples were extracted using TRIzol Reagent (Invitrogen) and separated using 2-dimensional gel electrophoresis (2-DE) with pH gradient range of 4–7 in the first dimension and 9% SDS-PAGE gel in the second dimension (GE Healthcare). Proteins were detected by silver staining and spot distribution pattern was analyzed using PDQuest 7.2 software (Bio-Rad).

We have analyzed a fragment of proteome: proteins with the isoelectric point (pI) 4–7 and the molecular weight <40 kDa, because the protein spot separation in 2-DE in this area was clearly distinguishable (Figure 1). Firstly, using PDQuest software, for each volunteer was generated an artificial gel, by combining protein expression profiles from sham and exposed samples. Thereafter, all 10 artificial gels were combined into single artificial master gel and the differentially expressed protein spots, which were detected in at least 4 volunteers, were statistically analyzed.

thumbnailFigure 1. Artificial master gel for all sham and exposed skin samples of all 10 volunteers. Statistically significantly affected protein spots are marked in red color (declined expression) and in green color (increased expression).

The ratio of exposed and sham sample expression was analyzed spot by spot, after logarithm transformation, with variance analysis (anova). Due to small numbers and potential violations of model assumptions, the ratios were also studied with the Wilcoxon test. The statistical analysis has identified 8 differentially expressed proteins where the change in expression was statistically significant among the 579 identified proteins spots (Table 1). Two of the protein spots (#3701, #4801) were present in all 10 volunteers thus showing that it is possible to find common, responding proteins among the all volunteers. The p-values are not adjusted for multiple comparisons.

Table 1. List of proteins that were present in at least 4 volunteers and which expression has been changed in statistically significant manner (<0.05) as determined by the variance analysis and the Wilcoxon test. Ratio = exposed sample expression/sham sample expression.

Discussion

Proteomics approach to study effects of mobile phone radiation on cells has been used so far only by two research groups, ours in Helsinki and group the Zhejiang University, Hangzhou, China. Our studies, using human endothelial cell lines have shown that mobile phone radiation induces statistically significant changes in the expression of several tens of proteins [6] and that the response of cell might be proteome-dependent [7]. In one study, the group in China has not found statistically significant differences in protein expression in MCF-7 cells [9]. The reason for it might be too low number of experiments in MCF-7 study [9]. In our studies statistical analysis was based on 10 different experiments whereas Zeng et al. [9] based their analysis on only three replicates. Another reason for the difference might be different sensitivity of MCF-7 cells as compared with ours endothelial cell lines EA.hy926 and EA.hy926v1. In the other study from Zhejiang University [10] were found 4 differentially expressed proteins in lens epithelial cells, among them the stress response protein Hsp70.

The obtained results, suggesting effect of mobile phone radiation on protein expression in human cell lines, do not automatically mean that this exposure will have any effect on protein expression in humans. The so far conducted human volunteer studies have focused on cognitive responses to RF-EMF [2] and there is no information available about the proteome, as well as transcriptome, response to mobile phone radiation in humans. This study is, to our knowledge, the first one where human response to RF-EMF was examined on molecular level. Our results suggest that human skin might respond to RF-EMF and change protein expression profile. Interestingly, when adjusting results of our previous cellular study [6] using the size of proteome analyzed in the present study (pI 4–7; <40 kDa) the number of the statistically significantly affected proteins appears to be similar in this and in earlier [6] study, 8 spots and 9 spots, respectively. The number of differentially expressed protein spots in both studies is below the number of expected false positives. However, as we have demonstrated experimentally [6] and discussed previously [11] it is likely that some of the proteins will be indeed, real positives. However, without further testing, it is not possible to predict whether these changes will have impact on skin physiology.

Finally, our study confirms that the proposed by us proteomics approach [3] can identify protein targets of RF-EMF. This approach to EMF research has been subsequently accepted by the EMF scientists [12,13] and has been included into the 2006 World Health Organization Research Agenda [14]. However, new and larger study is urgently needed to strengthen our pilot observations and to determine what impact mobile phone exposure might have on human tissues.

Conclusion

▪ Mobile phone radiation might alter protein expression in human skin.

▪ Physiological significance of this change is not known and requires further study.

▪ Larger human volunteer study will be needed to confirm results of this pilot study.

▪ Proteomics screening is valid method for search for molecular targets of mobile phone radiation. Without this approach the identification of the proteins responding to mobile phone radiation would not be reasonably possible.

Methods

Ethical issues

Ethical permit to perform this study was obtained, in accordance with the Helsinki Declaration, from the Ethics Committee of the Department of Surgery of the Hospital District of Helsinki and Uusimaa, Finland (decision #127/2005 issued on November 23, 2005). Each volunteer was informed in detail about all experimental procedures and each of them has signed the informed consent form (in Finnish language).

Exposure of volunteers to mobile phone radiation

Volunteers were exposed to 900 MHz GSM mobile phone radiation in an experimental setup described in detail elsewhere [8]. The source of irradiation was a half-wave dipole fed with a computer controlled GSM phone. The specific absorption rate (SAR) induced in the skin was 1.3 W/kg what is below the ICNIRP safety guidelines (2.0 W/kg). During the exposure small area of the right forearms was irradiated for one hour. The other, non-irradiated forearm was used as sham control. Immediately after exposure skin punch-biopsies were taken from the exposed and non-exposed skin for protein analysis.

Protein extraction from skin biopsies

Skin punch biopsies, consisting of both dermis and epidermis but without the underlying fat tissue, were frozen immediately after harvesting in liquid nitrogen and stored at -80°C. Isolation and separation of proteins were performed in the blinded manner. Proteins were isolated from frozen skin using TRIzol® reagent protocol as described by the manufacturer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) with a few modifications. Briefly, the chopped skin punch-biopsies were immersed in 0.5 ml of ice-cold TRIzol reagent and homogenized on ice with 70 strokes of the pestle in DUALL 1 ml tissue grinder (Kimble Chase Life Science and Research Products, Vineland, NJ, USA). After the phase separation of TRIzol reagent, the organic phase containing DNA and proteins was collected. DNA was then precipitated with ethanol and proteins were isolated from the phenol-ethanol supernatant. The proteins were then precipitated by isopropyl alcohol and pelleted at 12000 × g for 10 min at +4°C. The protein pellet was washed 3 times with 0.3 M guanidine hydrochloride solution in 95% ethanol and once with 99.5% ethanol. During the extraction pellets were grinded with pellet pestle in order to improve the solubility of the proteins. After each wash step, proteins were centrifuged 7500 × g for 5 min at +4°C. The air-dried protein pellet was dissolved in 2-DE rehydration buffer containing 9 M urea, 2% (w/v) CHAPS, 0.5% (v/v) IPG buffer pH 4–7 and 5 mg/ml DTT (added as fresh). The protein concentration of sample was measured using the Bradford method. The samples were stored at -80°C.

Protein separation with 2-DE

Proteins were separated by standard 2-DE. Briefly, the first dimension was performed in IPGphor™ (GE Healthcare, UK) isoelectric focusing (IEF) apparatus. Linear, 24 cm long, pH 4–7 Immobiline™ DryStrip gels (IPG-strips, GE Healthcare, UK) were rehydrated in the strip holders for 4 hours in 0.45 ml rehydration buffer containing 9 M urea, 2% (w/v) CHAPS, 0.5% (v/v) IPG-buffer pH 4–7, 1.2% (v/v) DeStreak™ reagent, a trace of bromophenol blue and 150 μg of total amount of protein. IEF was carried out at +20°C using following step-and-hold settings: 50 V, 8 h; 100 V, 1 h; 500 V, 1 h; 1000 V, 1 h; 2000 V, 1 h; 8000 V, until 95000 Vh was achieved. Then, the IPG-strips were incubated at room temperature in equilibration buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.8, 6 M urea, 30% (v/v) glycerol, 2% (w/v) SDS, a trace of bromophenol blue, and 10 mg/ml DTT) for 15 min and for another 15 min in the same buffer that contained 25 mg/ml of iodoacetamide instead of DTT. The second-dimension separation was performed using 9%SDS-PAGE gels. Electrophoresis was carried out at +10°C using an Ettan™ DALTsix electrophoresis unit (GE Healtcare) at a constant power of 3.5 W/gel for 0.5 h and then 13 W/gel until the dye front reached the bottom of the gel (about 4 h). The ready gels were silver stained to visualize protein spots. Stained gels were scanned into computer using GS-710 Calibrated Imaging Densitometer (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). The gels were analyzed using PDQuest 7.2 software (Bio-Rad).

Abbreviations

CHAPS, 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate; 2-DE, 2-dimensional electrophoresis; DTT, dithiothreitol; EA.hy926, human endothelial cell line; ICNIRP, International Commission on Non-Ionizing Radiation Protection; IEF, isoelectric focusing; IPG, immobilized pH gradient; MCF-7, human breast adenocarcinoma cell line; pI, isoelectric point; RF-EMF, radiofrequency modulated electromagnetic field; SAR, specific absorption rate; SDS, sodium dodecyl sulfate; SDS-PAGE, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis; Tris-HCl, Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride;

Authors’ contributions

AK executed the proteomics experiments and performed analysis of the proteomics data. RN assisted in designing of the study, participated in writing the grant funding the study, assisted in analysis of proteomics data. SH performed statistical analysis of the data. DL conceived and designed the study, obtained grant funding the study, coordinated execution and analysis of the results and wrote the draft manuscript. All authors participated in the writing of the final version of the manuscript, read it and approved it.

Acknowledgements

We thank Dr. J. Halttunen (Central Hospital of the University of Helsinki) for taking skin biopsies. Funding was provided by Tekes – Finnish Funding Agency for Technology and Innovation (HERMO project) and by STUK- Radiation and Nuclear Safety Authority.

References

  1. Krewski D, Glickman BW, Habash RW, Habbick B, Lotz WG, Mandeville R, Prato FS, Salem T, Weaver DF: Recent advances in research on radiofrequency fields and health: 2001–2003.

    J Toxicol Environ Health B Crit Rev 2007, 10:287-318. PubMed Abstract | Publisher Full Text OpenURL

  2. Seitz H, Stinner D, Eikmann T, Herr C, Röösli M: Electromagnetic hypersensitivity (EHS) and subjective health complaints associated with electromagnetic fields of mobile phone communication – a literature review published between 2000 and 2004.

    Science of Total Environment 2005, 349:45-55. Publisher Full Text OpenURL

  3. Leszczynski D, Joenväärä S: Proteomics: new way to determine possible biological effects of mobile phone radiation.

    Nature Genetics 2001, (Suppl 27):67. Publisher Full Text OpenURL

  4. Leszczynski D, Joenväärä S, Reivinen J, Kuokka R: Non-thermal activation of the hsp27/p38MAPK stress pathway by mobile phone radiation in human endothelial cells: molecular mechanism for cancer- and blood-brain barrier-related effects.

    Differentiation 2002, 70:120-129. PubMed Abstract | Publisher Full Text OpenURL

  5. Leszczynski D, Nylund R, Joenväärä S, Reivinen J: Applicability of discovery science approach to determine biological effects of mobile phone radiation.

    Proteomics 2004, 4:426-431. PubMed Abstract | Publisher Full Text OpenURL

  6. Nylund R, Leszczynski D: Proteomics analysis of human endothelial cell line EA.hy926 after exposure to GSM 900 radiation.

    Proteomics 2004, 4:1359-1365. PubMed Abstract | Publisher Full Text OpenURL

  7. Nylund R, Leszczynski D: Mobile phone radiation causes changes in gene and protein expression in human endothelial cell lines and the response seems to be genome- and proteome-dependent.

    Proteomics 2006, 6:4769-4780. PubMed Abstract | Publisher Full Text OpenURL

  8. Toivonen T, Toivo T, Puranen L, Jokela K: Setup and dosimetry for exposure of human skin in vivo to RF-EMF at 900 MHz.

    Bioelectromagnetics 2007, in press.

    DOI 10.1002/bem.20383

    PubMed Abstract | Publisher Full Text OpenURL

  9. Zeng Q, Chen G, Weng Y, Wang L, Chiang H, Lu D, Xu Z: Effects of global system for mobile communications 1800 MHz radiofrequency electromagnetic fields on gene and protein expression in MCF-7 cells.

    Proteomics 2006, 6:4732-4738. PubMed Abstract | Publisher Full Text OpenURL

  10. Li HW, Yao K, Jin HY, Sun LK, Lu DQ, Yu YB: Proteomic analysis of human lens epithelial cells exposed to microwaves.

    Jpn J Ophtalmol 2007, 51:412-416. Publisher Full Text OpenURL

  11. Leszczynski D: Mobile phone radiation and gene expression.

    Radiation Res 2007, 167:121. PubMed Abstract | Publisher Full Text OpenURL

  12. Leszczynski D: The need for a new approach in studies of the biological effects of electromagnetic fields.

    Proteomics 2006, 6:4671-4673. PubMed Abstract | Publisher Full Text OpenURL

  13. Leszczynski D, Meltz ML: Questions and answers concerning applicability of proteomics and transcriptomics in EMF research.

    Proteomics 2006, 6:4674-7. PubMed Abstract | Publisher Full Text OpenURL

  14. World Health Organization: [http://www.who.int/peh-emf/research/rf_research_agenda_2006.pdf] webcite

    WHO Research Agenda for Radio Frequency Fields. 2006. OpenURL